先找到基因的mRNAX序列。

引物设计参数：

a

引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。

b

引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer

5，primer

6，primer

express等一般可以设置在55-58度，beacon

design可以设置在65左右。

c

GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。

d

产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不好区分，超过200bp可能会影响PCR扩增。

e

软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。

f

引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。